今天我們要來(lái)談一談劃痕實(shí)驗(yàn)（scratch assays），確切的說(shuō)，是傷口愈合實(shí)驗(yàn)（Wound healing）。提到這一類的實(shí)驗(yàn)，想必很多實(shí)驗(yàn)室的同胞們會(huì)對(duì)其設(shè)計(jì)、操作和結(jié)果分析感到十分困惑：如何保證劃痕的均勻一致？結(jié)果如何分析？為什么每次實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性很差？其實(shí)，當(dāng)大家沉浸在劃痕實(shí)驗(yàn)的愛(ài)與痛中的時(shí)候，結(jié)合納米材料與微孔板全自動(dòng)成像技術(shù)已經(jīng)占領(lǐng)3D世界的Wound healing assay了！

對(duì)于如何實(shí)現(xiàn)3D培養(yǎng)水平的損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)，先不談實(shí)驗(yàn)技術(shù)本身，我們來(lái)確認(rèn)一下這種模型的意義，大家都知道，Scratch assays本身是為了評(píng)估細(xì)胞的損傷修復(fù)和遷移的能力，而生物體內(nèi)真實(shí)的損傷修復(fù)都是在極為復(fù)雜的細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下進(jìn)行的，可以理解為，真實(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境是一個(gè)多民族聚集的三次元大家庭，而不是現(xiàn)在我們大多數(shù)實(shí)驗(yàn)條件限制下構(gòu)建的二次元模型。因此，如果采用3D培養(yǎng)細(xì)胞模型來(lái)進(jìn)行損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)，才能夠獲得更加貼近體內(nèi)的研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，避免許多彎路。

那么各位一定和我一樣有這樣幾個(gè)問(wèn)題：3D培養(yǎng)模型應(yīng)該很難構(gòu)建吧？如何方便的檢測(cè)3D細(xì)胞培養(yǎng)模型？能快速實(shí)現(xiàn)結(jié)果定量分析嗎？對(duì)于這些技術(shù)層面的問(wèn)題，BioTek都有輕松的解決方案。

Q1：如何實(shí)現(xiàn)3D細(xì)胞woundhealing模型的構(gòu)建？聽(tīng)起來(lái)不簡(jiǎn)單?。?/span>

       伴隨著材料學(xué)的進(jìn)步，通過(guò)n3D公司的基于納米材料的“磁力懸浮”系統(tǒng)構(gòu)建體外3D wound healing模型，這種模型構(gòu)建方式最大的優(yōu)勢(shì)是3D成球速度非常快，原本需要數(shù)天甚至數(shù)周以上的模型構(gòu)建周期，如果采用磁力懸浮系統(tǒng)，僅需15分鐘至數(shù)小時(shí)即可構(gòu)建。操作方法的示意圖見(jiàn)下圖所示：

圖1：”磁力懸浮系統(tǒng)”構(gòu)建3Dwound healing模型示意圖。A，加入生物親和性的納米材料磁化細(xì)胞。B，將磁化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至頂部帶有磁子的6孔板中使其懸浮自然形成胞外基質(zhì)（ECM）。C，形成胞外基質(zhì)的細(xì)胞體系轉(zhuǎn)移至底部具有環(huán)形磁子的384/96孔Woundhealing 模型培養(yǎng)板中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。

由此可見(jiàn)，采用這種磁力懸浮系統(tǒng)，能夠快速有效的構(gòu)建形成胞外基質(zhì)的3D損傷愈合模型。生命科學(xué)的研究往往是從量變到質(zhì)變的積累突破，只有樣本量達(dá)到一定的數(shù)量，我們才能獲得有效的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，之前我們可能認(rèn)為培養(yǎng)數(shù)個(gè)3D細(xì)胞球已經(jīng)很難了，更何況是要進(jìn)行多個(gè)樣品重復(fù)，評(píng)估多種藥物/化合物或刺激因素呢？而我們這里介紹的這個(gè)模型，恰好非常有效地解決了樣本通量的問(wèn)題。

Q2，3D模型雖然很好，但是不好檢測(cè)啊，有人用Confocal拍一個(gè)3D細(xì)胞球都要好幾個(gè)小時(shí)，這幾十上百個(gè)的，如何獲得結(jié)果？

    這個(gè)問(wèn)題，就要輪到大名鼎鼎的Cytation^TM系列多功能細(xì)胞成像檢測(cè)儀登場(chǎng)（詳細(xì)介紹請(qǐng)回顧公眾號(hào)歷史消息）。Cytation^TM成像模塊最大的特點(diǎn)就是，“想怎么拍，就怎么拍”，無(wú)論我們是想拍小視頻、多視野拼圖、多色熒光疊、Z-軸層切、無(wú)固定視野多孔拍攝等等，Cytation^TM都只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的程序就能一次搞定，還能讓你實(shí)現(xiàn)任意時(shí)間的活細(xì)胞自動(dòng)監(jiān)測(cè)，是不是很方便？像今天介紹的這種3D wound healing模型，我們需要對(duì)每個(gè)細(xì)胞團(tuán)清晰成像，最好還能在不同時(shí)間點(diǎn)成像，這樣能夠更全面的評(píng)估損傷愈合的過(guò)程（圖2，3）。

圖2：Cytaiton對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)3D培養(yǎng)的未給藥組模型損傷愈合情況自動(dòng)拍攝的圖像。4X物鏡，相差成像。

圖3：Cytaiton對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)3D培養(yǎng)的給藥組（cytochalasin D）模型損傷愈合情況自動(dòng)拍攝的圖像。

以上兩張圖清晰地展示了無(wú)藥物處理的3D細(xì)胞模型，每隔一定時(shí)間成像檢測(cè)結(jié)果顯示所有細(xì)胞逐漸向中心區(qū)域遷移，使這個(gè)環(huán)形“傷口”逐漸向中心愈；而使用了細(xì)胞松弛素D的模型組，環(huán)狀的3D 細(xì)胞團(tuán)不再向中間生長(zhǎng)，提示損傷修復(fù)功能受到抑制。

除了相差或明場(chǎng)的觀測(cè)，如果我們想要評(píng)估多種細(xì)胞混合培養(yǎng)以后，每種細(xì)胞的遷移或增殖速度，就需要用到熒光標(biāo)記或熒光蛋白轉(zhuǎn)染的方法了，由于Cytation可以自動(dòng)對(duì)多通道熒光疊加成像，我們也可以在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)行更多的研究。

圖4：Cytation^TM熒光成像通道展示表達(dá)RFP的成纖維細(xì)胞在共培養(yǎng)3D wound healing模型中的分布。

Q3，光有圖片怎么行？我們需要用數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)話，這個(gè)模型如何進(jìn)行圖像定量分析？

從前面可以看出，基于磁力懸浮系統(tǒng)構(gòu)建的3D woundhealing模型，是通過(guò)評(píng)估環(huán)形3D細(xì)胞球的細(xì)胞向中心遷移的程度來(lái)反應(yīng)損傷愈合的過(guò)程，隨著細(xì)胞遷移，環(huán)形3D細(xì)胞球的總面積減少。因此，我們需要從圖片上獲得環(huán)形3D細(xì)胞球總面積的實(shí)時(shí)變化。Cytation^TM檢測(cè)平臺(tái)系統(tǒng)的控制及分析軟件Gen5，帶有多種靈活的圖像分析功能，包括細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞面積、細(xì)胞周長(zhǎng)、細(xì)胞亞群分析、多Mask圈選、多種曲線擬合等功能。在進(jìn)行圖像分析時(shí)，同樣只需要編輯數(shù)個(gè)分析步驟，即可對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的圖像進(jìn)行分析。因此，即使是384孔板的N個(gè)時(shí)間點(diǎn)的圖像，Gen5軟件也能快速自動(dòng)化幫大家得到分析結(jié)果。

圖5，Gen5軟件展示對(duì)3Dwound healing模型的分析結(jié)果。AB，給藥組及對(duì)照組樣品細(xì)胞金色輪廓Mask圈選，統(tǒng)計(jì)總面積。右上，每隔30mins，連續(xù)監(jiān)測(cè)16h的不同給藥濃度條件下，對(duì)HT1080細(xì)胞3D模型的損傷修復(fù)曲線。右下，16h后，Cytochalasin D的損傷修復(fù)抑制作用的Dose-Response曲線及IC50值（可點(diǎn)擊放大圖片查看）。

圖5非常棒的展示了Gen5強(qiáng)大的圖像分析運(yùn)算能力，右上角的動(dòng)力學(xué)損傷愈合曲線，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的一張圖像的分析結(jié)果，而評(píng)估一個(gè)化合物一般需要8個(gè)濃度梯度，一共32個(gè)時(shí)間點(diǎn)，因此這一個(gè)實(shí)驗(yàn)需要分析256張以上的圖像，如果再做重復(fù)樣品，則需要更大的樣品分析量。如果沒(méi)有Cytation^TM和Gen5軟件的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，恐怕這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，我們?cè)缫淹鴧s步啦。而現(xiàn)在，我們不但有基礎(chǔ)的動(dòng)力學(xué)曲線，還能輕松獲得每個(gè)藥物的EC/IC50，提供嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乃帉W(xué)研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，無(wú)需將大量的數(shù)據(jù)樣本在不同的分析軟件中來(lái)回轉(zhuǎn)移。

對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)，大家關(guān)心的三個(gè)問(wèn)題，在Cytation&Gen5的聯(lián)合出擊下，都應(yīng)迎刃而解，而需要你做的，就是動(dòng)用聰明的大腦，去設(shè)計(jì)更多有趣、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)項(xiàng)目，而不用擔(dān)心耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力，去做重復(fù)性的勞動(dòng)來(lái)進(jìn)行圖像捕獲及數(shù)據(jù)分析。